實驗目的

(1)掌握幾種常用的細菌染色方法。

(2)初步了解細菌的形態和結構特征。

細菌的個體形態主要分為球菌、桿菌和螺旋菌(圖)3-1）。除了細胞壁、細胞膜等基本結構外，一些細菌細胞還具有孢子、莢膜、鞭毛等特殊結構，是細菌分類鑒定的重要指標。由于細菌細胞小而透明，在顯微鏡下直接觀察時難以識別，因此通常需要染色才能觀察形狀和結構。生物染色染料主要包括堿性染料、酸性染料和中性染料。在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷，而堿性染料在電離時帶正電荷，因此很容易與細胞結合，使細菌著色。因此，堿性染料主要用于細菌染色。常用的堿性染料有美藍、晶紫、番紅、孔雀綠等。

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圖3-1細菌基本形態顯微照片a．球菌；b．桿菌；c螺旋菌細菌染色的方法有很多，以下是幾種常用的染色方法。

簡單的染色方法：一種用染料染色細菌的方法。該方法操作簡單方便，僅適用于觀察細菌列。

丹麥病理學家Hans Christian Gram它成立于1884年，是細菌學中很重要的鑒別染色方法。革蘭氏染色后，各種細菌可分為革蘭氏陽性細菌（G＋）和革蘭氏陰性菌（G-）兩類。其基本步驟分為：結晶紫初染、碘液體染、乙醇（或丙酮）脫色和番紅復染。一般認為，革蘭氏染色原理與細菌細胞壁的結構和組成有關。G+細胞壁肽聚糖層厚，脂質少。乙醇脫色時，肽聚糖會因脫水而縮小網孔，降低滲透性，從而保留晶體紫色-碘復合物在細胞膜上，細胞呈紫色；G-細胞壁肽聚糖層薄，脂質多，乙醇溶解脂質，增加細胞壁滲透性，結晶紫色-碘復合物溶于細胞壁，番紅復染使細胞呈紅色。

芽孢染色法:芽孢是一種圓形或橢圓形的休眠結構，由某些細菌在其生長發育后期在細胞中形成(圖3-2a）。細菌孢子壁厚致密，透氣性低，不易著色。孢子染色法是根據孢子不易染色，一旦染色后難以脫色的特點設計的。在加熱條件下用堿性染料孔雀綠染色，使染料不僅進入菌體，而且進入孢子。進入菌體的染料洗滌后脫色，孢子著色后難以洗滌脫色。當用對比度較高的復染劑染色時，孢子仍然保留初始染料的顏色，細菌被染成復染劑的顏色，使孢子和細菌容易區分。

莢膜染色法:莢膜是一種被細菌細胞包圍的粘性物質，由多糖、糖蛋白或肽組成。由于莢膜與染料的親和力弱，不易著色，通常采用負染色法染色，即菌體和背景著色，而莢膜不著色，在菌體周圍形成透明圈(圖)3-2b）。由于莢膜含水量高，生產過程中通常不需要熱固定，以免夾膜變形，影響觀察。鞭毛染色方法：細菌鞭毛非常細，直徑一般為10~20nm，只能用電子顯微鏡觀察(圖)3-2c）。然而，如果使用特殊的鞭毛染色方法，也可以在普通光學顯微鏡下看到。鞭毛染色方法有很多，但其基本原理是相同的，即在染色前用媒體染料處理，使其沉積在鞭毛上，使鞭毛加厚，然后染色。

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圖3-2細菌特殊結構的顯微照片(引自)M.T.馬迪根）a細菌芽孢；b細菌莢膜；c．細菌鞭毛

【實驗設備】

1菌種金黃色葡萄球菌（Staphy loccocus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、膠質芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）或自備菌種。

2.染色液和試劑草酸銨結晶紫、盧哥碘液、95%酒精、番紅、5%孔雀綠水溶液、繪畫墨水、硝酸銀染色液、二甲苯、柏油等。3.廢液缸、洗瓶、載玻片、接種環、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡、小試管（75mm×10mm）、燒杯、滴管、玻片架、鑷子、吸水紙、記號筆等。

【實驗步驟】

1簡單染色法

(1)涂片:在干凈無油膩的玻片中央放一小滴水，按照無菌操作方法(圖)3-3）用接種環挑選少量金黃色葡萄球菌或大腸桿菌菌種，與水滴完全混合，涂上極薄的細菌膜。注：細菌量應適當，涂抹均勻，避免細菌過多導致涂層細胞積累，難以看到細菌的個體形式。

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   圖3-3制備涂層的無菌操作過程a接種環滅菌；b．拔管塞；c管口滅菌；d．取菌種；e管口滅菌；f．塞管塞；g．涂布；h燃燒接種環

(2)干燥:讓涂層自然干燥或用吹風機吹干。

(3)固定:手持玻片一端，讓菌膜向上，通過火焰兩三次(玻片背面不燙手為宜)。注意:涂層干燥后要加熱固定，避免因固定時間過長而損壞細胞形態。

(4)染色:將涂片放在玻片架上，加入適量草酸銨結晶紫色液染色(以覆蓋菌膜為宜)1~2min。

(5)水洗:倒入染色液，用洗瓶小水沖洗，直至涂片上的水無色。

(6)干燥:用吸水紙吸水，自然干燥或用吹風機吹干。

(7)鏡檢:涂片完全干燥后鏡檢查，從低倍鏡到高倍鏡，用油鏡觀察。簡單染色法的操作流程見圖3-4。

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圖3-4簡單的細菌染色法(引自M.T.馬迪根）

2.革蘭氏染色法

（1）生產：取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌斜培養物常規涂層、干燥、固定（同上）。注：應選擇幼年培養物、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌24h。涂片宜薄，以免脫色不完全造成假陽性。

(2)初始染色:滴加結晶紫(適合覆蓋菌膜)染色1~2min，水洗。

(3)媒染:用碘液沖去殘水，用碘液覆蓋約1min，水洗。

（4）脫色：將玻璃傾斜。在白色背景下，用滴管和95%乙醇脫色，直到乙醇剛好無紫色。注：革蘭氏染色成敗的關鍵是乙醇脫色。如果脫色過多，革蘭氏陽性細菌可能染成假陰性；如果脫色時間過短，革蘭氏陰性細菌也可能染成假陽性。

(5)復染:用番紅液復染2min，水洗。

(6)鏡檢:干燥后，用油鏡觀察。

3。芽孢染色法

(1)制作:按常規方法將大芽孢桿菌涂片、干燥、固定(同上)。

（2）染色：在涂片上加入5%孔雀綠染色液，用木夾夾住載玻片一端，用微火加熱酒精燈上方，用染料蒸汽而不沸騰，并開始計時5min。注：加熱過程中不要讓染色液沸騰，及時補充染色液，不要讓涂層干燥。

(3)水洗:玻片冷卻后，用水輕輕沖洗，直到流出的水中沒有染色液。

(4)復染:用番紅液染色2min。

(5)水洗:用水洗去染色液。

(6)鏡檢:干燥后用油鏡觀察。4.莢膜染色法

(1)混合物:在干凈的載玻片上加入1滴墨水，挑選少量膠質芽孢桿菌菌體與其充分混合。

（2）覆蓋玻璃：在混合物上放一個清潔的覆蓋玻璃，然后在覆蓋玻璃上放一張濾紙，輕輕壓下，吸收多余的細菌液體。注：不要產生氣泡，以免影響觀察。

(3)鏡檢:先用低倍鏡，再用高倍鏡觀察。

5.鞭毛染色法(硝酸銀染色法)

(1)菌種準備:取經活化的蘇云金桿菌。

(2)準備載玻片:將載玻片在含有適量洗衣粉的水中煮沸20min，取出，用清水徹底清洗，瀝干后浸泡在95%乙醇中，用時取出燒在火焰上的酒精和可能殘留的油漬。(3)菌液制備:斜菌種數環于1~2mL在無菌水試管中，制成菌懸液。

（4）生產：將細菌液滴在玻璃的一端，傾斜玻璃，使細菌液慢慢流向另一端，用吸水紙吸收玻璃下端多余的細菌液，室溫自然干燥。

(5)染色:涂片干燥后，滴入硝酸銀染色A液覆蓋3～5min，用蒸餾水沖洗A液。用B沖去殘水后再加液B液覆蓋涂層染色數秒至1min，當涂層表面出現明顯的棕色時，立即用蒸餾水沖洗。如果添加請添加。B液后顯色較慢，可用微火加熱，直至顯褐色時立即水洗。自然干燥。

(6)鏡檢:干燥后用油鏡觀察，可從玻片一端逐漸移動到另一端觀察。

【實驗報告】

1．實驗結果

(1)繪制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的形態圖，并注明革蘭氏染色結果。

(2)繪制芽孢桿菌形態圖(表示芽孢位置)。

(3)畫鞭毛細菌的形態圖。

2．思考題

(1)革蘭氏染色時，為什么特別強調菌齡不能太老，用老齡細菌染色會出現什么問題？

(2)觀察芽孢菌素、莢膜和鞭毛結構時使用的菌齡有什么區別？(張應烙)